显微镜拉曼光谱基于拉曼散射效应。当特定波长的单色激光(如532nm、633nm或785nm)照射到样品上时，光子会与物质分子发生非弹性碰撞。这种碰撞并非简单的反射或折射，而是涉及到分子内部能量状态的改变。
能量交换产生频移：在碰撞过程中，部分光子将一部分能量转移给分子，使自身频率降低，形成斯托克斯散射；反之，若分子原本处于较高能态并释放能量给光子，则光子频率会增加，形成反斯托克斯散射。这两种情况均导致散射光的频率不同于入射光，且携带了关于分子振动、转动等信息的特殊“指纹”。
信号收集与分析：通过显微镜系统准确聚焦于样本上的微小区域，确保只有该区域的散射光被有效收集。随后，这些散射光经过光谱仪分散成不同波长的光，并由检测器记录下其强度分布，生成拉曼光谱图。此图谱反映了样品的结构、成分及状态等关键信息。
显微镜拉曼光谱的测定步骤：
1.设备启动与初始化
-激光主机开机：将激光主机上的电源开关打开，再将钥匙逆时针转动以激活激光。
-显微镜开机：开启显微镜左侧绿色按钮，并调节右侧光源至合适亮度(中间状态为关闭；向上/下按动分别控制上下打光)。
-电脑及软件准备：打开计算机，启动配套的拉曼光谱仪和显微镜控制软件，登录用户账号。在显微镜软件中选择对应的相机型号进入实时画面。
2.样品放置与定位
-载样方式：固体样品可直接置于载玻片上，液体需覆盖盖玻片后固定于载玻片；确保样品表面平整、无气泡且厚度控制在1mm以内(过厚可能导致信号衰减或散射增强)。
-粗调焦观察：通过物镜从小到大的顺序逐步调焦，直至视野清晰显示样品图像。随后切换至激光模式，在软件界面观察到红色光斑后微调位置，使光斑集中明亮。
3.参数设置与校准
-测量模式选择：根据实验需求设定激发光源功率、积分时间、光谱范围等参数。例如，对敏感样品应降低激光功率以避免损伤；对于弱信号样本可延长积分时间提高信噪比。
-系统校准：包括波数校准和强度校准，确保数据准确性；同时检查外光路是否对准，必要时调整聚光部件使会聚光束聚焦于样品中心。
4.数据采集与分析
-单次/多次采集：点击软件中的“单次”按钮开始测量，重复多次以验证结果稳定性。采集后的光谱以图形形式呈现，可通过软件工具进行基线校正、峰位识别等处理。
-数据保存与解读：导出原始数据及处理后的图谱，结合数据库或文献对比特征峰归属，得出成分或结构信息。
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